La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método eficaz y uno de los más utilizados en las ciencias biológicas para la multiplicación in vitro de una molécula de ADN diana. Las estrategias basadas en la PCR son utilizadas por clínicos e investigadores para diagnosticar enfermedades, clonar y secuenciar genes y realizar estudios cuantitativos y genómicos de forma rápida y muy sensible. Esta técnica nos ayuda a detectar y amplificar la región genómica de interés antes de su uso directo, o como insumo de otras técnicas diagnósticas más especializadas. En el laboratorio implementamos la metodología clásica y muchas otras variaciones de esta (qPCR, RT-PCR, dPCR, TP-PCR, RT-qPCR, nested PCR, long PCR, entre otras) para estandarizar y validar diferentes pruebas de diagnóstico molecular.

La hibridación genómica comparativa (aCGH) es una técnica que permite detectar cambios en el número de copias cromosómicas sin necesidad de cultivar células. Proporciona una visión global de las ganancias y pérdidas cromosómicas en todo el genoma. La principal ventaja de la aCGH es la capacidad de detectar simultáneamente aneuploidías, deleciones, duplicaciones y/o amplificaciones de cualquier locus representado en un array; un ensayo con esta técnica equivale a miles de experimentos de FISH, con el consiguiente ahorro en mano de obra y gastos. Además, la aCGH ha demostrado ser una potente herramienta para la detección de anomalías cromosómicas submicroscópicas en individuos con retraso mental idiopático y diversas anomalías congénitas. Automatizando la extracción de ADN directa de líquido amniótico (sin cultivo celular previo), logramos optimizar el tiempo y calidad de procesamiento del array, consiguiendo material genético más íntegro y con mejor índice de pureza, obteniendo resultados más confiables.

El análisis de fragmentos es un método de análisis genético que comprende una serie de técnicas en las que los fragmentos de ADN se marcan con fluorescencia, se separan por electroforesis capilar y se clasifican por comparación con un patrón interno. La técnica proporciona información sobre el tamaño, la cuantificación relativa y el genotipo, utilizando fragmentos de ADN marcados con fluorescencia, producidos por PCR con primers diseñados para una diana de ADN específica. Esta información nos permite detectar diferencias en los alelos, homocigosis y heterocigosis, quimerismo, mezclas de muestras y herencia. Las expansiones de tri o hexanucleótidos, la MLPA y la MS-MLPA son ejemplos de las pruebas que actualmente estandarizamos y validamos en el laboratorio, apoyándonos de herramientas tecnológicas robustas (SeqStudio o SeqStudio Flex de Applied Biosystems), que nos permite obtener resultados confiables y reproducibles.

Esta novedosa tecnología es el método más potente para la generación rápida de secuencias de lectura larga. Sus ventajas más destacadas incluyen la ausencia de labels, las lecturas ultralargas (104–106 bases), el alto rendimiento y el bajo requerimiento de material. Cada una de ellas simplifica el proceso experimental y puede utilizarse fácilmente para aplicaciones de secuenciación de ADN. Mediante este tipo de secuenciación, se puede secuenciar una sola molécula de ADN o ARN sin necesidad de amplificación por PCR ni etiquetado químico de la muestra. Tiene el potencial de ofrecer un genotipado de coste relativamente bajo, una gran movilidad para las pruebas y un procesamiento rápido de las muestras con la capacidad de mostrar los resultados en tiempo real. Actualmente nos encontramos estandarizando y validando la metodología para su uso en el equipo minION para diferentes aplicaciones diagnósticas (genómica, transcriptómica y modificaciones químicas).

La tecnología NGS, o secuenciación de alto rendimiento, hace referencia a plataformas capaces de secuenciar grandes cantidades de ADN en paralelo con un método de detección simultánea de secuencias, generando secuencias cortas para ensamblaje (short reads), y logrando un coste por base mucho más económico que el de Sanger. Los sistemas Illumina, usados en el laboratorio, pueden utilizarse para una amplia gama de aplicaciones que incluyen resecuenciación, secuenciación del genoma completo, secuenciación del exoma, metagenómica, estudios epigenéticos y secuenciación de paneles de genes. Automatizando la extracción de muestras purificadas de ADN a partir de sangre total, saliva y tejido parafinizado, hemos optimizado el proceso previo a la creación de librerías y secuenciación, obteniendo reads de mejor calidad, comparados con extracción de ADN manual, y mejorando el tiempo de procesamiento total.

Por medio de esta técnica (implementada en el SeqStudio o SeqStudio Flex de Applied Biosystems) se determina la secuencia de bases nucleotídicas en un fragmento de ADN (normalmente de menos de 1.000 pb de longitud). Tiene una precisión del 99,99%, por lo que se considera el gold standard para validar secuencias de ADN, incluidas las ya secuenciadas mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Además, es una estrategia de análisis robusta capaz de determinar si existe una mutación puntual o una pequeña deleción/duplicación. En el laboratorio se estandarizan y validan diferentes aplicaciones de esta técnica, como la definición del espectro mutacional de un tumor, o la identificación de variantes constitucionales en pruebas diagnósticas. Diseñamos primers que cubren varias regiones (amplicones) que abarcan regiones genómicas de interés de cualquier tamaño, de acuerdo con las necesidades diagnósticas personalizadas del paciente.